汉献帝初平二年,孙坚被刘表的部将黄祖射死,孙策依附了袁术。孙策在袁术手下立了不少功劳,但不被重用,于是决定自立门户。他向袁术提出要渡江援救舅舅丹杨(今安徽宣城县)太守吴景,袁术同意了。孙策一边招兵买马,一边派人送信给周瑜,请他前来相助。周瑜马上领兵前去会合。孙策叫周瑜去协助他的叔叔周尚镇守丹杨。原来,袁术已经命自己的堂弟袁胤前往丹杨,要取代周尚为太守,孙策不想丹杨成为袁术的势力范围。但是,周尚没有违抗袁术的命令,他带着侄儿周瑜来见袁术。可是,周瑜认为他最终难成大事,于是,在汉献帝建安三年(198年),周瑜寻找机会投奔了孙策。孙策听到周瑜前来,亲自出迎,马上授予他“建威中郎将”之职。
周瑜天性喜爱音乐,精通音律,孙策便又送给他许多乐器。这一年,孙策和周瑜都刚好24岁,孙策娶了美女大乔,周瑜娶了美女小乔。
孙策、周瑜进击寻阳,大破据守寻阳的庐江太守刘勋,再向西攻击刘表的部将江夏太守黄祖。黄祖只身而逃,妻子儿女都被孙策军俘虏了。平定了豫章(今江西南昌)、庐陵(今江西吉安)后,周瑜留守巴丘(今江西巴丘)。汉献帝建安五年(200年),孙策外出打猎,被仇家射死。周瑜和张昭共同主持军政大事,辅助孙策的弟弟孙权。
公元200年,曹操在官渡大胜袁绍,下书孙权,要他送儿子入许都做人质。孙权召集群臣商议,张昭、秦松等犹豫不决。周瑜说:“我建议将军不应听从曹操的命令,而应该练兵积粮,等待时机。”于是,孙权决定不送人质。
建安十一年(206年),江夏太守黄祖派部将邓龙领数千人攻入柴桑(今江西九江),周瑜马上还击,生擒邓龙,送往吴郡由孙权落。建安十三年(208年),孙权讨伐黄祖,命周瑜为前部大都督。这场战争,孙权终于为父报了仇,射杀了黄祖,并且还得到了一员大将——甘宁。