汉献帝初平二年，孙坚被刘表的部将黄祖射死，孙策依附了袁术。孙策在袁术手下立了不少功劳，但不被重用，于是决定自立门户。他向袁术提出要渡江援救舅舅丹杨(今安徽宣城县)太守吴景，袁术同意了。孙策一边招兵买马，一边派人送信给周瑜，请他前来相助。周瑜马上领兵前去会合。孙策叫周瑜去协助他的叔叔周尚镇守丹杨。原来，袁术已经命自己的堂弟袁胤前往丹杨，要取代周尚为太守，孙策不想丹杨成为袁术的势力范围。但是，周尚没有违抗袁术的命令，他带着侄儿周瑜来见袁术。可是，周瑜认为他最终难成大事，于是，在汉献帝建安三年(198年)，周瑜寻找机会投奔了孙策。孙策听到周瑜前来，亲自出迎，马上授予他“建威中郎将”之职。
周瑜天性喜爱音乐，精通音律，孙策便又送给他许多乐器。这一年，孙策和周瑜都刚好24岁，孙策娶了美女大乔，周瑜娶了美女小乔。
孙策、周瑜进击寻阳，大破据守寻阳的庐江太守刘勋，再向西攻击刘表的部将江夏太守黄祖。黄祖只身而逃，妻子儿女都被孙策军俘虏了。平定了豫章(今江西南昌)、庐陵(今江西吉安)后，周瑜留守巴丘(今江西巴丘)。汉献帝建安五年(200年)，孙策外出打猎，被仇家射死。周瑜和张昭共同主持军政大事，辅助孙策的弟弟孙权。
公元200年，曹操在官渡大胜袁绍，下书孙权，要他送儿子入许都做人质。孙权召集群臣商议，张昭、秦松等犹豫不决。周瑜说：“我建议将军不应听从曹操的命令，而应该练兵积粮，等待时机。”于是，孙权决定不送人质。
建安十一年(206年)，江夏太守黄祖派部将邓龙领数千人攻入柴桑(今江西九江)，周瑜马上还击，生擒邓龙，送往吴郡由孙权落。建安十三年(208年)，孙权讨伐黄祖，命周瑜为前部大都督。这场战争，孙权终于为父报了仇，射杀了黄祖，并且还得到了一员大将——甘宁。